ニセプライフ ®6FF (IDA) アフィニティークロマトグラフィー媒体

ニッケルキレートアガロースクロマトグラフィー樹脂

Ni Seplife 6FF (IDA) 説明書

ニセプライフ ® 6FF (IDA) アフィニティークロマトグラフィーメディア製品プロファイル:

Niキレートアガロースクロマトグラフィー  （IDA）は6FFアガロース培地上でイミノジ酢酸を結合し、その後Ni2+イオンをキレート化して  アフィニティークロマトグラフィー媒体 広く使用されているのは  タンパク質の加工 、  核酸  そして  ポリペプチド精製  下流の  バイオファーミングとバイオエンジニアリング 。

ニセプライフ ® 6FF (IDA) アフィニティークロマトグラフィーメディア樹脂パラメータ:

ニセプライフ ® 6FF (IDA) アフィニティークロマトグラフィー媒体試験手順:

1.カラムパッキング
（１）全ての材料と試薬を室温に戻し、初期緩衝液と溶出緩衝液を調製する。
（２）カラムサイズに応じて樹脂サンプルを採取し、20％エタノールで洗浄して乾燥させ、緩衝液（樹脂：緩衝液の比率＝3：1）を使用してホモゲネートを作成し、脱気処理する。
（３）カラムの内側または底部を湿らせておくために水または緩衝液を使用してください。水または緩衝液のレベルはフィルター膜よりも高くする必要があり、カラムの底部が泡立たないことを確認してください。
（4）ガラス棒を使用して、ホモジネートをカラムの内面に沿って一度カラムに導き、気泡が入らないようにします。カラム出口バルブを開いて樹脂を自由に沈め、カラム上部のキャップをしっかりと接続します。
（５）蠕動ポンプを開き、緩衝液を使用して、通常使用する緩衝液の流量の1.33倍の流量でカラムを通過させます。2～3BV緩衝液を使用してカラムのバランスをとります。
2.均衡
導電率、pH、その他のパラメータが変化しなくなるまで、初期緩衝液の2～5倍のベッドボリュームでバランスをとります。
3.サンプルのロード
（１）サンプルは通常、pH6～8の初期緩衝液に溶解され、ローディング緩衝液のpHを上げるとローディング量を増やすことができます。
（２）緩衝液にはEDTAやクエン酸を含んではならず、メルカプトエタノールやDTTなどの還元剤も避けるのが最善です。
（３）一般的に用いられる緩衝液としては、１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液、２０～２００ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液などがある。
（４）イオン交換を排除するために、通常、緩衝液に０．１５～０．５ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを添加する。
（５）ニッケルキレートアガロースゲルを初めて使用する場合は、初期緩衝液として50mmol/L PBS（50mmol/L NaH2PO4、0.5mol/L NaCl、pH7.4）を使用することを推奨します。
4.溶出
溶出は一般的に以下の方法に分けられます。
（1）pH溶出の低減：ほとんどのタンパク質はpH 6〜4（pH 3〜4でも可）で溶出され、緩衝液は酢酸ナトリウム、クエン酸、リン酸緩衝液系になります。
（２）競合溶出：金属イオンに親和性のある競合物質の濃度を直線的に増加させるか、または増加させる（例：0～0.5mol/Lイミダゾール、0～50mmol/Lヒスチジン、0～2mol/L NH4Cl）。
（３）キレート剤溶出：EDTAやEGTAなどのキレート剤は金属イオンと反応してタンパク質を溶出させることができるが、この方法では異なるタンパク質を分離することができず、タンパク質の吸着に影響を与え、融合タンパク質を固定することができなくなる。

ニセプライフ ® 6FF (IDA) アフィニティークロマトグラフィー媒体 備考:

（１）初めて使用する場合、溶出に必要なイミダゾールの濃度が不明な場合は、最初の緩衝液に10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/Lを加えることをお勧めします。イミダゾールはそれぞれ低濃度から高濃度の順に溶出・回収され、溶出結果はSDS-PAGE電気泳動によって同定されました。
（２）イミダゾールはアルカリ性であり、対応する緩衝液を調製した後、HClでpHを調整する。
（３）pH溶出を下げてキレート剤を溶出させると金属イオンが脱落し、次回使用する前に金属イオンを再度キレート化する必要がある。
（４）条件に応じて、イミダゾールグラジエント直線溶出を実施し、好ましい溶出条件を決定することができる。
上記の溶出方法では、イオン交換を排除するために、150～500 mmol/L の NaCl をバッファーに添加する必要があります。
5.再生
（1）ゲルは繰り返し使用した後、またはキレート金属イオンを交換する必要がある場合は、ニッケルを除去して再生する必要があります。ニッケル除去方法：まずカラムを5～10ベッドボリュームの蒸留水で洗浄し、次にカラムを5～10ベッドボリュームの100 mmol/L EDTAで洗浄し、最後に2～3ベッドボリュームの0.5 mol/L NaClを使用して残留EDTAを洗い流します。
（2）複数回使用したカラムは、通常、ニッケル除去後に洗浄する必要があります。洗浄方法：カラムを0.1〜1.0mol/L NaOHで逆流させ、50cm / hで1〜2時間維持すると、強い不純物を除去できるだけでなく、熱源も除去できます。
（３）洗浄後の金属イオンの再キレート化。キレート化法：まず、ニッケル除去後のカラムを２～５ベッドボリュームの蒸留水で完全に平衡化し、次に０．１～０．３ｍｏｌ／Ｌの金属塩溶液を使用して５～１０ベッドボリュームを通し、金属イオンをキレート化する。５～１０ベッドボリュームの蒸留水ですすぎ、キレート化されていない金属イオンを除去する。
6.CIP
（１）イオン交換により吸着されたタンパク質の除去：ベッド容量の２～３倍の量を２mol/LのNaCl溶液で洗い流した。
（２）疎水性の強いタンパク質や脂質等の除去：ベッド容量の４倍量を70％エタノールまたは30％イソプロパノールで洗い流した。
（３）沈殿したタンパク質、疎水性タンパク質の除去：参照ゲル再生工程。
7.保管
密封し、4～30℃（保存溶液に20%エタノールを含む）で乾燥、換気、清潔、凍結せずに保存します。使用済みのカラムは4～8℃、20%エタノール溶液で保存します。

注意：
（１）サンプルとNiの寿命 ®6FF (IDA) は溶出バッファーで平衡化してからクロマトグラフィーカラムに送る必要があります。
（２）柱床は平らで、溝や気泡がない状態にしてください。そうでない場合は再度設置する必要があります。
（３）使用時には、カラムと緩衝液の温度が同じであることを確認し、カラムベッド内での気泡の発生を避け、精製効果に影響を与えないようにする。
（４）溶出プロセス中の流速は厳密に制御する必要があり、速すぎないようにする必要がある。
（５）充填中および溶出プロセス全体を通じて、シリンダー表面の乾燥が防止される。