溶出と再生

クロマトグラフィー媒体が使い果たされたら、溶出する必要があります。基本的な原理は、より活性なイオンまたは基によって目的の生成物を脱着することです。異なる吸着剤の活性は異なります。したがって、タンパク質を溶出するには適切な溶出液を選択する必要があります。  クロマトグラフィー媒体 。

イオン交換クロマトグラフィーの溶出方法は、おおよそ 3 つあります。
一つは同時溶出法である。溶出液は希酸、アルカリ、塩溶液が使用でき、適切な有機溶媒も使用でき、塩溶液が主に使用され、対象製品と最終製品の性質に応じた剤形が選択される。吸着される物質は単一種ではないことが多いため、各物質の電荷が異なり、媒体への結合力が異なります。同じ溶出液を使用しても、置換されやすい物質が最初に媒体から流出し、結合力が強い。物質が排出された後、分留によって収集されれば、さまざまな物質を分離して比較的純粋な製品を得ることができます。この方法は、対象製品の性能がよくわかっている場合の分離、または分析種の分離によく使用されます。

2つ目は段階的な溶出、つまり異なる濃度の塩溶液で溶出することです。分離媒体交換吸着プロセス中に、さまざまなタンパク質が吸着されます。一定の溶出条件を使用すると、すべての成分を適切に分離できない場合があり、溶出条件を変更する必要があります。段階的な変更、つまり、異なる溶出液または異なるpH値の溶出液を使用して段階的に溶出することができ、異なる溶出液濃度と異なる酸性度に応じて異なる溶出ピークが得られます。つまり、ある塩濃度で目的のタンパク質が得られ、異なる塩濃度で異なる目的タンパク質が得られます。この段階的な溶出方法は、既知の性質のタンパク質の分離に適しており、特に大規模生産に適しており、操作が簡単で制御が容易です。

3 つ目のタイプは連続グラジエント溶出です。つまり、溶出液のイオン強度または pH を一定の線形変化に従って変化させます (通常は pH を変更する溶出方法を使用する特殊な場合にのみ使用します)。溶出液のグレーディングのプロセスでは、異なるタンパク質が 1 つずつ置き換えられてさまざまなタンパク質成分が得られ、同時に、タンパク質は一般にテーリングされません。グラジエント溶出は、イオン交換クロマトグラフィーで最も一般的に使用される溶出方法であり、最も溶出能力が強い溶出方法でもあり、同様の電荷特性を持つ類似成分の溶出に適しています。

溶出プロセスでは、並流溶出または向流溶出のいずれかを使用できます。並流溶出は順方向溶出とも呼ばれ、つまり、溶出液の流れ方向は作動流体の流れ方向と同じであり、向流溶出は逆方向溶出とも呼ばれます。逆方向溶出の場合、溶出液の流れ方向は作動流体の流れ方向と反対です。供給液が交換カラムを介して上から下に交換され、吸着される場合、交換カラムの上層の吸着質の濃度は下層の濃度よりも高く、下から上への溶出液の逆脱着は、より効率的に溶出の目的を達成できます。ただし、逆溶出操作は順方向溶出よりもはるかに複雑なため、ほとんどの場合、正の溶出に基づいています。

溶出液の流速もイオン交換クロマトグラフィーの分離に影響し、溶出速度は通常一定に保たれます。一般に、遅い溶出の分解能は速い溶出よりも優れていますが、溶出速度が遅すぎると、分離時間が長くなり、サンプルの拡散、スペクトルピークの広がり、分解能の低下などの副作用が発生するため、実際の状況によって異なります。適切な溶出速度を選択してください。溶出ピークが特定の領域に比較的集中して重なり合う場合は、グラジエント範囲を適切に縮小するか、溶出速度を下げて分解能を上げる必要があります。分解能は良好だが溶出ピークが広すぎる場合は、溶出速度を適切に上げる必要があります。